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本产品是基于染料法荧光定量PCR原理开发。专门检测登革病毒1型的试剂盒。


登革病毒(Dengue Virus，DENV)是一种RNA病毒，主要通过埃及伊蚊和白纹伊蚊等媒介昆虫传播，可以引起登革热以及发病率和死亡率很高的登革出血热和登革休克综合征，登革热病毒分化成四大家族，被病毒学家称为DF-1、DF-2、DF-3、DF-4病毒型。

1. 一站式，用于不需要单独准备每种成分，包括引物和对照。
   
2. 根据登革病毒1型的保守基因序列设计的引物，具有良好的特异性。
   
3. 基于染料法qRT-PCR检测，灵敏度比常规RT-PCR高10～100倍，可以达到至少1000拷贝/反应。
   
4. 使用一管式qRT-PCR技术，RT和PCR两步在一个试管内完成，不需要中间转移样品，降低了操作误差和可能的污染。
   
5. 本产品足够50次20μL体系的RT-PCR，只能用于科研，不能用于临床。

组分	规格
2×qRT-PCR缓冲液	500μL
10×qRT-PCR酶混合液	100μL
ROX染料I，50×	20μL
ROX染料II，50×	20μL
荧光PCR专用模板稀释液	1mL
登革病毒1型染料法qRT-PCR引物混合液	100μL
登革病毒1型染料法qRT-PCR阳性对照(1×108拷贝/μL)	50μL

保存：-20℃，有效期一年。


一、稀释阳性对照(以10²～10⁷这6个10倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原。

1. 标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。用带芯枪头分别加入45μL
   荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同)。
   
2. 在7号管中加入5μL 1×10⁸拷贝/μL的阳性对照(本试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10⁷拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
   
3. 换枪头，在6号管中加入5μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁶拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
   
4. 换枪头，在5号管中加入5μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁵拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品RNA的制备

5. 如果有N个样品，必须设置N+2个提取，多出的一个是PC(样品制备阳性对照)，一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL上步制备的阳性对照梯度稀释液中的第4号(浓度为1×10⁴拷贝/μL，10μL相当于1万拷贝)再加上一定量的水作为制备的阳性对照(加水后其总体积跟样品一样，样品体积多少取决于所用试剂盒的要求)。可以用水作为制备的阴性对照。
   
6. 用自选方法纯化N+2个样品的RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒RNA提取试剂盒兼容。可以选购本公司的柱式病毒RNA提取试剂盒，其使用手册可以从本公司网站www.bjbalb.com，通过搜索产品名称或产品货号BTN71001下载。

三、设置RT-PCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)

7. 如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照，6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于PCR阳性对照(用第4号阳性对照稀释液做模板)。下面只描述定量分析的步骤，定性分析只是把6个标曲反应缩减成1个，其余不变。
   
8. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，阳性对照样品要等所有管子盖上盖子后最后加)：
   

   成分	样品管 N+2个	RT-PCR 阴性对照	RT-PCR阳性对照 (2～7管)
   2×qRT-PCR缓冲液	10μL	10μL	各10μL
   登革病毒1型染料法qRT-PCR引物混合液	2μL	2μL	各2μL
   50×ROX(见注)	0.4μL	0.4μL	各0.4μL
   样品制备所得RNA模板(来自于第8步)	5.6μL	-	-
   稀释所得6个阳性对照	-	-	各5.6μL
   10×qRT-PCR酶混合液	2μL	2μL	2μL

   注：
   需使用ROX染料I的机型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-One Plus。
   需使用ROX染料II的机型：ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research的Chromo4、Opticon(II)Corbett Rotor Gene 3000。
   不需要使用ROX的机型：Thermal Cycle Dice Real Time System，LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene3000、RotorGene 6000。
   
9. 上机后按下面参数进行RT-PCR(参数可能会因仪器不同而需优化)。
   

   过程	温度	时间
   RT(逆转录)	50℃	30min
   预变性	95℃	10min
   qPCR反应 (40个循环)	95℃	15sec
   	60℃	1min(采集SYBR通道的荧光信号)
   按仪器预设程序进行熔解曲线分析

四、数据处理

10. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于35。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。

相关搜索：登革病毒1型(DENV)荧光定量RT-PCR试剂盒(染料法)，Dengue Virus RT-qPCR Kit(SYBR)